从基因治疗法规看AAV生产中的关键质量分析

AAV载体因其感染效率高、宿主细胞范围广、免疫源性低等优势一直以来备受基因疗治领域青睐，截至日前，国内已有近20项AAV基因疗法申请或已获批临床试验。随着越来越多的AAV基因治疗产品步入IND，AAV生产的CMC（Chemistry, Manufacturing and Controls）也倍受关注，如何确保产品的安全性和有效性始终是质量控制的核心，也是监管机构审核的重心。

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2022年5月，国家药品监督管理局药品审评中心(CDE)发布了《体内基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》(以下简称《指导原则》)，对基因治疗产品的质量属性分析给出了系列指导，鼓励基于“质量源于设计”(QbD)的研发理念，建立全过程的质量控制体系和全生命周期的管理理念；通过全面的质量研究确认产品的关键质量属性(Critical quality attributes, CQA)，同时采用原理互补的不同分析方法进行研究。常见的质量研究项目包括(但不限于)：鉴别、结构分析、生物学活性、纯度、杂质、含量、感染效率、一般理化特性等。

本文将结合以上《指导原则》，对AAV生产过程中的CQA以及常用表征分析方法进行系统介绍。

鉴别与结构分析

对AAV载体的鉴别可以从AAV基因组序列、衣壳蛋白鉴定以及完整病毒颗粒鉴定等不同水平进行。

• 限制性内切酶本酶切图谱分析、聚合酶链式反应（PCR）、逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和核酸序列测定可用于确认病毒基因组、目的基因和相关的调控序列；同时要注意观察突变位点对遗传稳定性的影响；
• 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白免疫印迹(western blot)可用于对衣壳蛋白VP1/2/3进行鉴定；
• 镜下结构分析、颗粒大小分布、折光度分析等方法可用于对结构蛋白的表达和病毒颗粒的组装进行确认。

含量与生物学活性

产品含量即病毒数量，统一用“滴度”作为指标，包括病毒颗粒滴度(总颗粒数)、基因组滴度(基因组拷贝数)、结构蛋白含量、感染性滴度(感染性颗粒数)等不同类型。

最终产品的规格或剂量一般以病毒颗粒滴度或基因组滴度表示，同时通过控制感染性滴度以及感染性颗粒的比率保证活性病毒颗粒的数量，从而在保证产品疗效的同时能有效控制产品的免疫原性风险。

病毒颗粒滴度，也称为衣壳滴度，是以AAV颗粒作为计量单位，其中不免会存在空壳AAV颗粒，所以在生产工艺中对空衣壳进行有效分离与纯化是必不可少的关键步骤。酶联免疫吸附试验(ELISA)、透射电镜(TEM)、高效液相色谱(HPLC)、分析型超速离心技术(AUC)等是常见的测定方法，其中TEM与AUC一般只用来检测空壳AAV颗粒滴度与实心AAV颗粒滴度的比值。

基因组滴度测定的是含目标基因组的AAV浓度，理论上应该与感染性滴度呈线性关系，主要的测定方法有有PCR法、点杂交法（Dot-blot）和分光光度法等。

对病毒物理滴度的测定也是反映产品生物活性的方法之一，除此之外，还需用敏感细胞或靶向细胞测定其感染能力和目标产物表达能力以表征产品效力。

感染性滴度用于确定AAV目的基因组是否转移到细胞核并进行复制，这是AAV成功表达基因治疗产物的前提，也是反映产品质量和临床有效性的重要指标。目前最广泛使用的测定方法是采用半数组织培养感染剂量法（TCID50）来进行细胞体外感染。但是该方法精密度差，变异系数大，其中辅助病毒的稳定性、细胞类型、细胞数量、PCR引物体系、实验人员的操作等众多因素都会影响其定量数据，因此，对实验环境、实验参数控制等要求较高，所以目前国内大多数AAV基因治疗研发企业并不具备用TCID50进行感染滴度检测的能力。

作为致力于基因治疗技术的开发和应用的CDMO服务商， 宜明细胞不仅拥有TCID50检测技术，并且不断优化完善，迄今为止已成功助力多家企业完成AAV产品批放行检测，用于IND申报以及（研究者发起的临床试验研究用的）临床级别AAV产品放行。

纯度与杂质

在AAV生产下游，通常会有一系列纯化工艺对AAV载体原液中可能包含的各类杂质与污染物进行层层过滤与清除。这些杂质大体来自三个方面：产品相关杂质、工艺相关杂质以及其他微生物或相关组分。为控制产品质量，除纯化工艺之外，还需对其中会影响产品安全性和有效性的CQA进行表征分析，以保证其在限定范围内。

在产品相关杂质中，《指导原则》特别指出需关注“可复制型病毒”对产品安全性的潜在风险，并建议将可复制型腺病毒 （Replication-Competent Adenovirus，RCA）控制在 1 RCA/3 ×10¹⁰VP （Viral particals）以内。

复制型腺相关病毒(rcAAV)是AAV生产过程中的一项产品相关杂质，属于一种错误包装的病毒，其形成主要源自于AAV载体质粒和辅助质粒间发生了同源/非同源重组，其在辅助病毒存在的条件下可以进行复制扩增。目前，rcAAV常见的检测方法是在辅助病毒存在下使用敏感细胞进行多轮感染扩增，细胞裂解后再进行基因组提取，最后采用DNA免疫印迹法(Southern blot)和qPCR法测定rep(调节基因) 或cap(结构基因) 。

在现阶段，使用qPCR法检测rcAAV限度值的居多。宜明细胞采用qPCR法并已建立了完善的rcAAV检测体系，目前已完成了多种血清型的检测方法开发，rcAAV含量检测结果均低于控制标准。

▲ 不同血清型rcAAV含量检测结果

除rcAAV外，空壳病毒颗粒是众所周知的一项重要的产品相关杂质，它不仅影响AAV产品的效力，并且会在患者体内产生免疫原性，可能带来致命风险。因此，除了纯化方法，AAV空壳率的表征检测技术也十分关键。

AAV空壳率的常见表征技术包括分析超速离心技术(AUC)、阴离子交换色谱法(AEC)、TEM、毛细管凝胶电泳、qPCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)、光密度法(OD)等常用技术。

TEM常用于检测AAV样品空壳率、聚集和纯度等指标。这一方法样品制备简单，结果直观。但是TEM因其低通量、周转时间长以及具有挑战性的图像分析而受限。因此，在宜明细胞，TEM的结果常用于参考数据，与其他正交验证方法 (AEC、AUC等)一起评估。

AEC基于不同衣壳亚型的等电点差异，可以分离多种血清型空衣壳颗粒和完整衣壳颗粒。AEC具有较高的重复性以及中等精确度，其高通量和可重复性非常适于在大规模工艺开发中常规使用。

▲AEC：分离空壳与完整衣壳(数据源自:宜明细胞)

其中AUC因其远高于其他技术手段的分辨率，被业界视为检测空壳率的金标准，是测定聚合物，量化空衣壳、部分完整衣壳和完整衣壳相对含量的重要手段。

▲ Optima AUC（图片源于宜明细胞）

但是考虑到AUC的低通量、周转时间长以及对测试样品的量和纯度要求高等原因，AUC更适合作为正交方法来验证其它更快但是分辨率较低的方法，比如AEC。

宜明细胞的空壳率检测平台可完成AAV一站式自主检测，可高精准度、全面地（可覆盖各个血清型）表征AAV的空壳产品，大幅度提高空壳率方法学验证能力和放行检测的速度，确保高品质AAV产品的持续稳定供应，同时也可以为业内类似产品提供检测服务。

▲AAV样品的AUC沉降系数分布(数据A源自:DOI: 10.1016/j.omtm.2019.09.006;数据B源自: 宜明细胞)。图中各字母代表含义：E，空衣壳60s；P，部分完整衣壳60-100s; F,完整衣100s；X,不明物

此外，宜明细胞还使用毛细管凝胶电泳结合激光诱发的荧光检测方法来检测AVV生产过程中的残留物，这种方法组合可以看到非常微量的残留片段的大小，与相应标准的标准品进行对照具有很好的检测限。

另外，在AAV制造和纯化过程中还容易出现病毒聚集体，聚集体可能会降低病毒的感染滴度，从而降低产品功效，同时还会增加免疫原性风险。常用的检测方法包括A320/A260比值、动态光散射（DLS）、电子显微镜、场流分离-多角度激光光散射、差分离心沉降法（DCS）、纳米颗粒跟踪分析等。

在工艺相关杂质中，宿主细胞DNA是一项关键的质量分析对象，需对其残留量和残留片段大小进行控制。根据《指导原则》建议，尽量将残留 DNA 控制在10ng/剂以内，DNA残留片段的大小控制在200bp以下。常用的检测方法有Southern blot、PicoGreen染色和定量PCR等，如果基因载体和宿主细胞DNA有同源序列，则建议使用特异性更好的定量PCR法。

总而言之，产品纯度与产品的安全性息息相关，也是监管机构在审批过程的重点关注对象。对企业来说，一方面要不断优化生产工艺，基于风险控制来设计和选择工艺技术与生产原料，同时另一方面建立灵敏有效的CQA表征分析方法与相应的质量标准，进而对影响这些质量属性的关键工艺参数进行把控。鉴于生物药物的复杂性，对于同一质量属性，通常需要至少三种基于不同原理的方法进行交叉验证，以确保数据的准确性和可靠性，并且建议尽量在临床试验开展前完成方法学的开发和验证。

总结

AAV生产的质量控制贯穿于整个产品生命周期。临床申报阶段、临床试验阶段以及上市申请阶段，对工艺开发与产品质量属性都有不同侧重的要求，即使上市后生产工艺依然需要持续验证和优化，以更好地保证产品质量及质量稳定性。

与专注于药物研发的生物制药公司相比，成熟的CDMO企业无论是在工艺开发与设计、产品质量控制，还是申报材料的准备与沟通上，都具备更充足的资源与更丰富的经验。宜明细胞作为一站式基因治疗药物CDMO服务平台，配置有严谨的质量保证与专业的质量控制团队，能够满足所有GMP AAV项目的检测要求。

在宜明细胞服务的客户中，既有处于临床前研究阶段的，也有在进行新药临床试验申请的，或是进行临床1-2期生产的，宜明细胞均可根据客户需求提供定制服务，包括细胞库建库、工艺开发、方法学开发、稳定性研究，中试批生产等。宜明细胞在其质量管理体系中搭建了完整的文件管理体系，GMP文件数量超过千份，包含详细的技术标准资料、标准管理规程、标准操作规程和系统的记录性文件，用以保证生产过程的均一性、可复制性和可追溯性，这也是宜明细胞能够快速协助基因药物企业获得临床审批的重要原因之一。

为促进CGT产业的发展及尽最大可能服务CGT新药研发公司，最终惠及患者，宜明细胞联合医麦客，将于2022年7月15日举办2022年CGT“宜起创未来”高峰论坛暨宜明细胞苏州CDMO新基地开业仪式。本次会议将邀请国内外一线细胞与基因治疗行业和临床专家，瞄准基因治疗的最新研究动态和进展，针对基因治疗的临床监管、治疗规范、细胞治疗安全性等业内关切的问题，进行充分探讨。

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